1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。
　　1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。
　　1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。科克兰、荷瓦斯制备成功薄壳型固定相，这种在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳，实现了高速传质，为高效液相色谱技术的发展奠定了稳固的基础。随着填料粒径的降低，更高的柱效也得以实现。1960年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液相色谱的要求。1970年代，往复式双柱塞恒流泵，解决了这一问题。1970年代后科克兰制备出全多孔球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效，并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动相的组成事提高选择性的关键。

　　高压——压力可达150～300kg/cm2。色谱柱每米降压为75kg/cm2以上。
　　高速——流速为0.1～10.0mL/min。
　　高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。
　　高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。
　　HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
　　速度快——通常分析一个样品在15～30min，有些样品甚至在5min内即可完成。
　　分辨率高——可选择固定相和流动相以达到分离效果。
　　灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
　　色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
　　样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
　　TLC与HPLC都是很重要的方法，TLC简便快捷，成本低，有些是HPLC不可替代的，比如说展开剂就可以用任何性质强烈的试剂进行分离以便达到预期目的，这些是主要是由于色谱柱的限制的HPLC所不能比拟的，所以TLC在中间体控制，中药材鉴别和某些中药材含量测定，以及在合成工艺中的反应程度控制等等都占有不可替代的作用。HPLC专属性和准确性要高，在某些TLC转化成HPLC是一种趋势，从国家的现行标准同以前的标准上就可看出，HPLC的方法应用有很大比例的提高。在一次检查中，HPLC只能做一个样，TLC上可以同时展开很多。TLC的成本也较低。由于二者的不同特点，通常在实验中，先进行TLC，展开后挖出所需部分（带有硅胶）进行HPLC。或者先用纸层析，之后将纸粉碎，再进行HPLC。
　　在HPLC中，随着固定相的发展,有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。HPLC成为解决生化分析问题最有前途的方法。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。液相色谱-质谱连用技术受到普遍重视，如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等；液相色谱-红外光谱连用也发展很快，如在环境污染分析测定水中的烃类，海水中的不挥发烃类，使环境污染分析得到新的发展。同时气相色谱-质谱连用技术也得到了广泛的应用。