反相色谱(RPC)是指利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。与HIC一样，RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性。因此，必须用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液进行溶质的洗脱分离。
　　溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。当固定相一定时，可以通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。RPC主要应用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可以用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活，所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。、
　　反相介质的商品种类繁多，其中代表性的是以硅胶为载体，通过表面键合非极性分子层制备。通过控制反应时间和温度，可获得性能稳定的反相介质。在硅胶基质的反相填料中，以键合有C18、C8、C2的球形多孔填料最为常见，用途最广。
　　RPC固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离。在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、异丙醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作为流动相。

　　(1)柱长
　　有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加．但是柱长增加并不能使蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率显着增加．它们在较短的柱子上往往也有很好的分离效果。
　　(2)流动相的流速。
　　有机小分子和肽类的分辨率对流动相流速非常敏感。而蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率则不然。流速越小，柱子越长，色谱峰的宽度就越大，分辨率就越小。制备色谱上样过程中的流速对动态吸附容量影响很大。
　　(3)温度。
　　温度上升，流动相黏度下降，流动速度加快，且流动相与固定相之间的传质速度加快，使分辨率增加。同时，温度上升，分子热运动增加，疏水性作用减弱。升高温度要考虑目标物质的热稳定性。
　　(4)流动相组成。
　　流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，洗脱时间越短。RPC多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。水是极性最强的溶剂，在反相色谱中常常和基础溶剂配合使用，向流动相中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶剂，以得到不同强度的流动相，这些有机溶剂称为修饰剂。反相色谱中最常用的有机溶剂有甲醇和乙腈。此外，乙醇、四氢呋喃、异丙醇及二氧六环也常被用作修饰剂。有机溶剂梯度的大小也会影响分辨率，一般梯度越小．分辨率越大。
　　样品保留值
　　反相色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定，保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大．对于非极性化合物通常遵循以下规则：(弱)非键合硅胶《氰基<C1(TMS)<C3<C4<苯基<C8≈C18(强)。溶质保留值与固定相表面积成正比，普通载体(80A°)的比表面积约为250m2/g，而300A°孔径载体的比表面积约为60m2/g。当其他条件相同时，溶质在300A°孔径(低表面积)色谱柱上的保留值大约为80A°孔径色谱柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨柱有利于强亲水性样品洗脱。样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于有机溶剂的性质和其在流动相中的浓度。在反相色谱中，采用高溶剂强度、低极性的流动相时可获得较低的保留值。固定相的不同也可以导致选择性发生变化，氰基柱、苯基柱、C8柱、C18柱等的选择性有很大差异，一般应优先考虑C8柱、C18柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱。
　　据统计，近80%的有机物及无机物可以用高效液相色谱法进行分离．其中反相色谱中的C18柱是高效液相色谱中最为常用的一类色谱柱。

　　色谱柱是HPLC系统非常关键的一部分，随着色谱技术的发展，它也不断地更新换代，长度变得越来越短，填料颗粒也越来越细。现在常用的色谱柱长度在30～250mm，颗粒直径在1.6～5μm。颗粒类型主要有全多孔和表面多孔，全多孔填料具有更大的柱容量、更多键合相选择的优点，表面多孔具有反压低、峰形好的优点。
　　目前最常用的基质是硅胶。以前填料纯化技术不是很成熟，十八烷基键合到硅胶表面不是很完全，硅胶上总是少量的硅羟基裸露在外面。这样就造成样品在进行色谱分离的时候，会吸附或者键合在这部分硅羟基上，导致色谱峰拖尾。使用三乙胺作为封尾剂，先行与硅羟基吸附，可以使峰型改善，这个三乙胺曾经一度成为分析界的宝贝和机密。现在，制造填料的技术日趋成熟，人们已经掌握了把这部分剩余未键合硅胶也进行键合钝化的技术，这个技术就叫作封尾。
　　现在每家色谱柱的制造商都有其独特的键合技术，常规的键合基团有C8、C18、苯基、氨基、五氟苯基、氰基、裸硅胶等。以下简单介绍一下每种色谱柱的适用范围。
　　1、C18柱C18色谱柱是目前最常用、每个实验室必备的通用型色谱柱。填料是硅胶基质上键合十八烷基，有较高的碳含量和较好的疏水性，适用于大多数化合物，包括非极性、极性小分子及一些多肽及蛋白质。随着每家色谱柱制造商的研发，C18柱的类型还在不断增加。适用pH范围由原来的2～8，发展到现在1～14，与纯水相的兼容性越来越好，某些色谱柱即使长时间使用100%水相，也不会发生填料疏水塌陷。对于每位实验人员来说，可供选择的范围日趋广泛。
　　2、苯基柱苯基柱与C18柱相似，是在硅烷基上键合一个苯环。这造成了对于有些特殊的化合物(如芳香族化合物)在反相保留时与C18有不同的选择性。在某些条件下，可以将C18无法分离的化合物分离。
　　3、五氟苯基柱五氟苯基柱的填料颗粒是硅烷基上键合一个五氟苯基。与常规的C18保留机制相似，但提供了不同的分离选择性，提高了对极性样品的保留，特别是对卤族化合物。
　　4、氨基柱氨基柱是在硅胶的硅羟基上键合了酰胺基，属于HILIC模式的色谱柱，其保留机制比较复杂，主要是液液分配、吸附作用、离子相互作用和亲水性保留作用的多模式组合。主要用于分析极性大的化合物，还适合用于糖类化合物的分析，如1，5一脱水葡萄糖醇。主要的优点是可以使用高有机相分析反相保留弱的化合物，对质谱离子化有更好的兼容性，提高检测灵敏度。
　　5、裸硅胶柱未杂化的硅胶颗粒色谱柱在日常的分析中也常用于液相色谱一质谱联用方法，硅胶柱与氨基柱有相似的保留基质及优点，同属HILIC模式的色谱柱。主要用于极性化合物的分析，特别是强极性碱性水溶性化合物，如生物碱、肾上腺素系列。

　　在液质联用中，一般均使用极性溶剂进行洗脱。反相色谱中洗脱强度顺序为：水<甲醇<乙腈<乙醇≈丙酮，亲水作用色谱中洗脱强度顺序为：丙酮<乙腈<乙醇<甲醇<水。通常可以通过改变流动相的溶剂强度和类型来改善化合物的保留和选择性。
　　改变流动相洗脱能力通常会引起保留时间的改变，部分化合物可以此作为改善分离度的手段。但有些化合物通常是结构类似的化合物，不能通过改变溶剂强度而增加分离度，这时改变流动相的组分，例如，调整pH、添加缓冲盐或离子对试剂可能是个可行的选择。对于某些不能有效分离的化合物，使用两种混合溶剂(甲醇和乙腈)作为有机相，可能会得到不错的分离效果。
　　串联质谱在使用缓冲盐时需要考虑是否与质谱兼容，必须使用挥发性试剂。通常使用甲酸、乙酸、氨水作为pH调节剂，甲酸铵、乙酸铵作为缓冲盐，三氟乙酸和三乙胺作为离子对试剂。有以下几点需要注意。
　　(1)甲酸、乙酸、氨水与甲酸铵、乙酸铵一起使用具有的缓冲效率，注意盐在溶剂中的溶出度，防止析出。
　　(2)在负离子模式下加入酸，会抑制大部分化合物的质谱信号响应。
　　(3)在调节流动相pH前，必须充分了解所用色谱柱的pH范围，如超出，将大大降低色谱柱寿命。
　　(4)亲水作用色谱一般会使用5～50 mmol/L的盐，来达到改善峰形和保留的目的。

　　反相介质性能稳定。分离效率高，可分离蛋白质、肽、氨基酸、核酸、甾类、脂类、脂肪酸、糖类、植物碱等含有非极性基团的各种物质。
　　例如使用C8和C18改造的硅胶柱的高压液相来制备和分析四环素类抗生素，对于四环素类抗生素来说．用氧化铝、硅胶、离子交换树脂等来进行制备性分离会显得极性太强。反相色谱硅胶Lichroprep RP一18和RP一8的发展提供了一个新的分离介质。应用四环素、土霉素、金霉甲烯土霉素和强力霉素作材料，用Lichroprep RP一18高效低压柱，溶剂系统中甲醇、乙腈、0.1 mol/L乙二酸(pH 3.0)的配比为5：0.5：10，能成功地在这几种抗生素的混合物中有效地分离出四环素、金霉素、甲烯土霉素和强力霉素。
　　作为产品纯化制备手段，应用反相介质分离，相对价格较高，多限于实训室规模的应用，在大规模工业生产中应用较少。