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PCR芯片阅读:381

实时定量PCR是检测基因表达最灵敏、最可靠的方法,但由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因,因而每次实验只能检测少数几个基因的表达水平,若要检测大量基因,则工作量巨大,耗时长久。经过对实时定量PCR体系进行优化开发出的PCR芯片,可同时进行多种基因的研究,并且还可节省在数据分析方面所花费的时间,使研究者可以在更短的时间内得到更丰富的信息,PCR芯片可广泛用于生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域,是近年生命科学领域常用的研究手段之一。

操作步骤

  采用PCR芯片进行实验只需2小时。PCR芯片实验过程:首先将RNA样品反转录为cDNA第一链,作为PCR模板;接着,将模板加入到反应体系(RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR Master Mix)中。在已经固定好基因特异性引物的96孔板各孔中,加入等量的PCR反应体系,进行PCR反应。采用仪器配套的软件计算PCR芯片中的每个基因的循环阈值(Ct)。最后,采用△△Ct方法比较对应的两个样本中同一基因的表达量变化。通过分析看家基因Ct值的一致性,可确定合适的标准化方法。芯片所设置的对照,可以检测PCR体系中是否存在DNA污染,或者是否有影响反转录或PCR实验步骤的因素存在。

技术难度

  采用PCR芯片开展研究,技术上的难点是如何在同一次实验中,相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率,并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度,特异性和可重复性。因此首先设计筛选出最佳的候选引物,接着通过实验,在不同反应条件下,检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合,最终获得了优化的引物和PCR反应体系,适应PCR芯片的要求。

检测数量

  根据一次实验所检测样品数量的多少,可将PCR芯片分为低通量和高通量PCR芯片。
  低通量PCR芯片的载体为96孔或384孔PCR反应板,仅须将制备好的样品cDNA加入相应的反应孔内,在荧光定量PCR仪上进行扩增即可。在灵敏度方面,每次扩增仅需400ng总RNA。但低通量PCR芯片所检测的基因数量有限,而且无法进行多个样品的多个基因的并行检测。低通量PCR芯片使用时和通常的定量PCR操作步骤相同,即从待检的生物样品(细胞、组织、血液等)中提取总RNA或分离出mRNA→经反转录形成cDNA→将所得的cDNA直接等量加入含有相应待检测基因引物的孔中→加入PCRmix→在荧光定量PCR仪上进行PCR定量检测→数据分析。
  高通量PCR芯片是在固相载体上固定有成百上千个基因的特异性引物,并且可同时检测高达成百上千个样品,达到同时并行检测多个样品的多个基因表达的能力。因此,具有检测通量高、耗时短和样品用量少的优点。由AppliedBiosystems公司研制的OpenArraySystem和Fluidigm公司开发的BioMarkSystem将荧光定量PCR技术与高通量芯片技术相结合,属于高通量PCR芯片,但这些芯片必须在特定的定量PCR仪器上使用进行。

优势

  PCR芯片与常规PCR相比:
  1、整体性:PCR芯片操作系统采用多基因扩增、结果分析一体化,操作简便;传统的PCR采用单基因扩增及结果分析,操作繁琐;
  2、时间:PCR芯片检测多个基因的时间是过去PCR检测单个基因的时间;
  3、试剂:传统PCR对试剂用量有要求,15微升以下就很难得到理想的扩增结果,PCR芯片可以扩增10微升以下的样品,这相应减少了试剂如Taq酶的用量,节省了实验经费也减少了废液污染。因此,与常规的PCR扩增技术相比,PCR芯片具有反应体积小、反应速度快、操作简便、价格低、样品用量少、无污染、节省试验成本、便于集成化、结果可靠的优点。

应用

  使用PCR芯片技术进行基因表达(信号通路或多个相关基因)的检测,已普遍用于生命科学研究的多个领域,如疾病发病机制研究,为研究结肠癌的程序性死亡(包括细胞凋亡和自噬)状态,Chang等应用PCR芯片同时检测癌症组织和正常组织中与细胞凋亡和自噬相关的22个基因的表达情况,发现肿瘤组织的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA表达水平是正常组织的4.01倍,而与程序性死亡和自噬相关的多个基因,包括肿瘤坏死因子受体(TNFR)、BCL2相关蛋白(Bax)、半胱天冬酶9(CASP9)、半胱天冬酶3(CASP3)及损伤控制的自噬调节子(DRAM)和抗紫外线相关基因(UVRAG)表达下调,说明肿瘤组织的代谢活性增加而凋亡速率降低,这可能是肿瘤组织增殖旺盛的原因。
  Karén等运用人类血管生长相关基因的96孔板PCR芯片检测了组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丙戊酸在体外对人微血管周细胞的血管发生作用的影响。结果表明,经丙戊酸处理后,人微血管周细胞中有涉及内皮细胞存活的血管生成素样4(ANGPTL4)和白介素-8(IL-8)、内皮细胞管成熟与稳定的成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)等14个基因表达改变,这些变化均可促进血管的稳定与成熟。提示PCR芯片作为一种快速、准确的技术手段,可应用于药物机理研究中。
  在食品安全检测中,李永新等建立了食品中沙门菌和单增李斯特菌的多重PCR-芯片电泳快速检测方法。根据沙门菌和单增李斯特菌的特征基因合成2对特异性引物,优化聚合酶链反应(PCR)体系,采用芯片毛细管电泳快速检测食品中上述2种致病菌的多重PCR扩增产物。在优化的实验条件下,6min内即可完成沙门菌和单增李斯特菌的同时检测;迁移时间的日内精密度为0.20%~1.7%,日间精密度3.7%~4.5%。

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