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分子排阻色谱法
阅读:468时间:2018-06-06 09:13:36

分子排阻色谱法又称空间排阻色谱法(SEC)是利用多孔凝胶固定相的独特性产生的一种,主要根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。分子排阻色谱又叫凝胶色谱法。

分类

  凝胶过滤色谱法-GFC(采用水溶液或缓冲液作为流动相)和凝胶渗透色谱法-GPC(采用有机溶剂作为流动相)

适用

  适用于对未知样品的探索分离,它能很快提供样品按分子大小组成的全面情况,并迅速判断样品是简单的还是复杂的混合合物,并提供样品中各组分的近似分子量。这种分离方法不宜用于分子大小组成相似或分子大小仅差10%的组分分析,如同分异构体的分离不宜用分子排阻色谱法。

分离机理

  1、主要取决于凝胶的孔径大小与被分离组分分子尺寸之间的关系,与流动相的性质没有直接的关系。
  2、样品分子与固定相之间不存在相互作用,色谱固定相是多孔性凝胶,仅允许直径小于孔径的组分进入,这些孔对于溶剂分子来说是相当大的,以致溶剂分子可以自由的扩散出入。样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻,只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱,首先从柱中被流动相洗脱出来;中等大小的分子能进入凝胶中一些适当的孔洞中,但不能进入更小的微孔,在柱中受到滞留,较慢地从色谱柱洗脱出来;小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞,在柱中受到更强的滞留,会更慢的被洗脱出;溶解样品的溶剂分子,其分子量最小,可进入凝胶的所有孔洞,最后从柱中流出,从而实现具有不同分子大小样品的完全分离。在分子排阻色谱法中,溶剂分子最后从柱中流出,这一点明显不同于其他液相色谱法。
  3、在SEC中,不同尺寸样品分子的分布系数K总保持在0~1之间。K=0说明溶质完全被排除在填料孔外,称为全排斥,即填料的排斥极限;K=1说明溶质可完全进入填料孔内。称为全渗透,即填料的渗透极限。
  4、对与某一大小分子其洗脱一体积等于流动相体积与该尺寸溶质可以渗透进入空洞内部的那部分体积的总和。Ve=Vo+KVp
  固定相:凝胶按机械强度分软质凝胶(葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶);半刚性凝胶(苯乙烯-二乙烯基苯共聚物);刚性凝胶(高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、多孔球形硅胶、羟基化聚醚多孔微球)。按化学性质分有机凝胶(均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶);无机凝胶(非均匀凝胶)。
  流动相
  凝胶渗透色谱法:常用四氢呋喃三氯乙烷
  凝胶过滤色谱法:以水为主体,具有不同PH值得多种缓冲溶液,所有溶剂使用前均要以微孔滤膜或5号砂芯漏斗过滤。除此之外,还需根据所分离的化合物性质向流动相中加入一些添加剂以改善保留和分离效果。如当使用亲水性有机凝胶作为固定相时,为消除体积排阻色谱法中不希望存在的吸附作用与基体的疏水作用,通常在流动相中加入少量的无机盐,以维持流动相的离子强度在0.1—0.5,减少副作用。

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