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亲和色谱
阅读:438时间:2018-06-05 10:28:12

亲和色谱也称为亲和层析,是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子,并且它们的结合是可逆的,在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子,也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。

概述

  20世纪初,俄国植物学家茨维特(Tswett)首次提出色谱法。他把碳酸钙粉末装到玻璃管中,将植物叶子的石油醚萃取液作为样品倒入管内,然后再用石油醚自上而下洗脱。随着洗脱的进行,植物叶子中的各种色素向下移动逐渐形成一圈圈的色带,茨维特将这种色带分离过程称为色谱(Chromatography),所用的玻璃管内的碳酸钙填充物称为固定相(stationaryphase),洗脱用的石油醚称为洗脱液或洗脱剂(eluent),也就是我们常说的流动相(mobilephase)。后来,采用该法分离了许许多多的物质,虽然分离过程中看不到色带存在,但色谱法一直沿用至今。
  色谱法在当今物质尤其是具有生物活性物质的分离中起到举足轻重的作用。然而在色谱发展的早期有许多的人往往将色谱看做一种艺术(art),但是随着色谱理论的发展,以及色谱技术的不断推广,色谱逐渐的称为了一种科学(science)。对于从事生物大分子分离的物质常常用一句话来形容色谱的重要作用:“色谱技术是当今生物工程下游技术的核心”。当今的色谱法包括分离和检查两部分,能够同时实现分离和分析。色谱法也必定会随着材料、生物等多学科研究的深入会更加广泛的应用到分离科学和分析化学之中的。

原理

  将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基(也称为配体),与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂,再用此亲和吸附剂填充色谱柱,当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时,亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质,而其他的蛋白质及杂质不被吸附,从色谱柱中流出,使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附,即可获得纯化的目的产物。

一般流程

  亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质,比如细胞内容物、培养基或血浆等。待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的基团捕获,而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱,目标分子即刻被洗脱下来。如果分离的目的是去除溶液中某种分子,那么只要分子能与介质结合即可,可以不必进行洗脱(这里有没有什么问题呢?如果不进行洗脱的话,柱子不能再生,没有实际应用价值吧,柱子多贵)。

应用

  亲和色谱的用途很广泛,可以用来从细胞提取物中分离纯化核酸、蛋白,还可以从血浆中分离抗体。分离重组蛋白就经常使用亲和色谱。通过基因修饰为蛋白加上一些人为的特性,这些特性使蛋白选择性地与配体结合,从而达到分离的目的。亲和色谱的另一大用途是从血浆中分离抗体。

影响因素

  1、上样体积
  若目标产物与配基的结合作用较强,上样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱,样品浓度要高一些,上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。(这个载量是什么意思,是指柱子所能吸附的最大量吗。。求大神解释T^T)
  2、柱长
  亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果亲和介质的载量(同上求解释T^T)高,与目标产物(目标物)的作用力强,可以选择较短的珠子(柱子);相反,则应该增加柱子的长度,保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。
  3、流速
  亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡需要一个缓慢的过程。因此,样品上柱的流速应尽量的慢,保证目标产物与配基之间有充分的时间结合,尤其是二者间结合力弱和样品浓度过高时。
  4、温度
  温度效应在亲和色谱中比较重要,亲和介质的吸附能力受温度影响,可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降,因此在上样时可选择较低的温度,使待分离物质与配基有较大的亲和力,充分地结合;而在洗脱时刻采用较高的温度,使待分离物质与配基的亲和力下降,便于待分离物质从配基上脱落。例如,一般选择在4℃进行吸附,25℃下进行解吸。

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