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凝胶色谱
阅读:461时间:2018-06-04 08:48:46

凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术,由于设备简单、操作方便,不需要有机溶剂,对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用,不但应用于科学实验研究,而且已经大规模地用于工业生产。

分类

  根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物,凝胶色谱又可分为凝胶过滤色谱(GFC)和凝胶渗透色谱(GPC)。
  凝胶过滤色谱
  凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子,
  如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列,洗脱溶剂主要是水。
  凝胶渗透色谱法
  凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相对分子质量分布分析及分离,常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶,洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
  凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布,同时根据所用凝胶填料不同,可分离油溶性和水溶性物质,分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
  凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质,不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。

分离原理

  一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时,各分子在柱内同时进行着两种不同的运动:垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大,不易进入凝胶颗粒的微孔,而只能分布颗粒之间,所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外,还可以进入凝胶颗粒的微孔中,即进入凝胶相内,在向下移动的过程中,从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入和扩散,小分子物质的下移速度落后于大分子物质,从而使样品中分子大的先流出色谱柱,中等分子的后流出,分子最小的最后流出,这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。
  各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围,有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的,就会全部被排阻在凝胶颗粒之外,这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同,也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙,即使它们的大小有差别,也不会有好的分离效果。因此,一定的分子筛有它一定的使用范围。
  一是分子很小,能进入分子筛全部的内孔隙;二是分子很大,完全不能进入凝胶的任何内孔隙;三是分子大小适中,能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开,但每种凝胶分离范围之外的分子,在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同,但同属于凝胶分离范围内各种分子,在凝胶床中的分布情况是不同的:分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内,而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内,这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短,分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床,这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外,凝胶本身具有三维网状结构,大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大,小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时,按照分子量大小排队,凝胶表现分子筛效应。

凝胶种类

  聚丙烯酰胺凝胶
  聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶,是以丙烯酰胺为单位,由甲叉双丙烯酰胺交联成的,经干燥粉碎或加工成形制成粒状,控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多,孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶-P(Bio-GelP),由日本tosoh的TSKGEL的pw系列,适合蛋白和多糖的纯化。即丙烯酰胺和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺,在催化剂过硫酸铵作用下聚合形成凝胶。
  聚丙烯酰胺简称PAM,分子量100~500万。聚丙烯酰胺主要有两种商品形式,一种是粉末状的,另一种是胶体,还有聚丙烯酰胺乳液(上海合成树脂研究所研制)。易溶于冷水,速度很慢,高分子量的聚丙烯酰胺当浓度超过10%以后.就会形成凝胶状结构。提高温度可以稍微促进溶解,但温度不得超过50℃,以防发生分子降解。难溶于有机溶剂。温度超过120℃时分解。中性,无毒。用作增稠剂、絮凝剂、减阻剂,具有凝胶、沉降、补强等作用。贮存于阴凉、通风、干燥的库房内,防潮、避光、防热。存放时间不宜过长。
  交联葡聚糖凝胶(Sephadex)
  ⑴SephadexG交联葡聚糖的商品名为Sephndex,不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示,G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如,G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克,同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10,G-15,G-25,G-50,G-75,G-100,G-150,和G-200。因此,“G”反映凝胶的交联程度,膨胀程度及分部范围。
  ⑵SephadexLH-20,是SephadexG-25的羧丙基衍生物,能溶于水及亲脂溶剂,用于分离不溶于水的物质。
  琼脂糖凝胶
  琼脂糖Agarose,缩写为AG,是琼脂中不带电荷的中性组成成份,也译为琼胶素或琼胶糖。琼胶糖化学结构由β-D-吡喃半乳糖(1-4)连接3,6-脱水α-L-吡喃半乳糖基单位构成。
  把琼脂糖,即几乎不含硫酸根的主要成分为多糖的琼脂,溶于热水,冷却制成的凝胶。制成的小颗粒用于凝胶过滤。适于用sephadex不能分级分离的大分子的凝胶过滤,若使用5%以下浓度的凝胶,也能够分级分离细胞颗粒、病毒等。利用其吸附性小的特点,有时用它代替琼脂、以作为免疫电泳或凝胶内沉降反应的支持物。
  琼脂糖凝胶商品名很多,常见的有,
  Sepharose(瑞典,pharmacia),Bio-Gel-A(美国,Bio-Rad)等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构,网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下,它的结构是稳定的,可以在许多条件下使用(如水,pH4-9范围内的盐溶液)。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化,也不能高压消毒,可用化学灭菌活处理。聚苯乙烯凝胶
  商品为Styrogel,具有大网孔结构,可用于分离分子量1600到40,000,000的生物大分子,适用于有机多聚物,分子量测定和脂溶性天然物的分级,凝胶机械强度好,洗脱剂可用甲基亚砜。

填料合成

  凝胶色谱填料合成技术的进展主要在下面四个方面:填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔径多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化学改性的发展。在这方面有较多的新产品,中国也有许多单位在研制和生产。高效凝胶色谱正在迅速改变凝胶色谱的应用面。
  四种多孔硅胶的理论塔板数
  高效色谱柱除了对填料的粒度有要求外,对粒度分布也要求相当窄。用一般的制备方法往往得到粒度较宽的产品,需要进一步过筛。当填料的粒度在30微米以下时,这种过筛非常困难,已经成为填料制备上一个较大的技术难关。Kirkland,利用了尿素和甲醛在酸性介质中形成大小均匀的液体高聚物,加入某种硅溶胶时,硅溶胶的微珠将在液体高聚物中凝聚。最后把有机高聚物灼烧掉后就能得到由微粒硅珠堆积而成的多孔填料。这种堆积硅珠是球形的,粒度分布很窄,填料的孔径决定于原始硅溶胶的规格,用不同的硅胶就可以制得不同孔径的填料。柴志宽等则利用一种硅胶制成粒度分布窄的填料后,再利用适当的扩孔方法以得到各种孔径的填料。从这些方法制得的微球填料,粒度分布可以达到相当窄,所以可以不经筛选直接使用。
  用 GPC和GPC-LALLS得到PS标样分子量比较
  随着进样技术和色谱柱接头设计的改进,已经可以得到柱效每米在八万到十万的凝胶色谱填料。Wheals用四种GPC用的微球硅胶装填色谱柱,都能达到每米八万到十万块塔板数的高效。他用这种色谱柱有效地进行了案件侦查中所要求的分析问题。

实验技术

  层析柱
  层析柱是凝胶层析技术中的主体,一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度,样品用量大,可加大柱的直径,一般制备用凝胶柱,直径大于2厘米,但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外,直径加大,洗脱液体体积增大,样品稀释度大。分离度取决于柱高,为分离不同组分,凝胶柱床必须有适宜的高度,分离度与柱高的平方根相关,但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞,一般不超过1米。分族分离时用短柱,一般凝胶柱长20-30厘米,柱高与直径的比较5:1─10:1,凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1,常用凝胶柱有50×25厘米,10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小,如果支掌滤板下的死体积大,被分离组分之间重新混合的可能性就大,其结果是影响洗脱峰形,出现拖尾出象,降低分辩力。在精确分离时,死体积不能超过总床体积的1/1000。
  凝胶的选择
  根据所需凝胶体积,估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍,例如Sephadex G-20的吸水量为20,1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好,但阻力大,流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好,脱盐用Sephadex G-25、G-50,用粗粒,短柱,流速快。
  凝胶的制备
  商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀,可用加热法,即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸,这样可大大中速膨胀,通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时,自然膨胀需24小时至数天,而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间,而且还可消毒,除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
  样品溶液的处理
  样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去,如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大,含蛋白为超过4%,粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4%(一般约0.5-2ml),进行分族分离时样品液可为凝胶床的10%,在蛋白质溶液除盐时,样品可达凝胶床的20-30%。分级分离样品体积要小,使样品层尽可能窄,洗脱出的峰形较好。
  防止微生物的污染
  交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质,防止微生物的生长,在凝胶层析中十分重要,常用的抑菌剂有:
  ⑴叠氨钠(NaN3)
  在凝胶层析中只要用0.02%叠氮钠已足够防止微生物的生长,叠氮钠易溶于水,在20℃时约为40%;它不与蛋白质或碳水化合物相互作用,因此叠氮钠不影响抗体活力;不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。
  ⑵可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]
  在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳,在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。
  ⑶乙基汞代巯基水杨酸钠
  在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01%。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合,因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
  ⑷苯基汞代盐
  在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01%。在微碱性溶液中抑效果最佳,长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀;还原剂可引起此化合物分解;含巯基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。

研究动向

  凝胶色谱的大量研究工作仍是多方面的,其中仪器、填料、联用技术、色谱理论等方面的进展是和整个液体色谱的进展相关的。但是下面四个研究动向意义较大,值得注意。
  通过与其他仪器联用,解决凝胶色谱法测定高聚物分子量分布从相对法向绝对法过渡。测定高聚物分子量分布是凝胶色谱最重要的应用。试样先根据分子体积(即分子量)分离后再检测各组分的分子量及含量。在凝胶色谱中试样的分离是在色谱柱中进行的,被分离后的组分在流出柱子时就同时连续地用浓度检测器和分子量检测器分别检侧各组分的浓度和分子量,把两个检测器的输出讯号用记录仪记录后即得反映分子量分布的凝胶色谱曲线。过去由于没有比较灵敏和瞬时响应的分子量检测器,因而利用一组不同分子量的标样来标定色谱柱,然后从分子量淋出休积的标定曲线来作数据换算。这种用相对方法来检测分子量虽然暂时解决了问题,但是随之而来的是实验工作量增加以及数据处理方法上存在困难。实验数据的可靠性在很大程度上决定于标定曲线、标样分子量数值以及数据处理方法的可靠性。其中色谱柱分离效率不理想所引起的色谱峰加宽效应的改正,不但实验方法比较烦琐,而且数据处理也比较复杂,需要用电子计算机来计算。所以虽然文献中已经推荐许多据说是比较满意的计算方法,但这总不是一个根本解决的方法。只有真正找到绝对分子量检测器,问题才算较好解决。原有的许多分子量测定方法,由于不能做到足够灵敏的瞬时响应而未能成功地在凝胶色谱上应用。
  Ouano用激光小角光散射仪(LALLS)来作分子量检测器得到比较好的结果。实验数据不需要标定曲线,也不必进行峰加宽改正。
  由于激光的准直性较好,强度较大,可以允许在较小的角度下测量较稀溶液的散射光强,由此可以直接计算出重均分子量的近似值而不需要象经典光散射那样实验数据还要对浓度和散射角度向零作双外推。实验上,凝胶色谱仪和激光小角光散射仪联用后,还可与计算机直接联接进行数据处理。在一次实验进行完毕后,所需要的数据可全部立即取得。GPC-LALLS似乎得到更合理的数值。激光小角散射仪已开始商品化,预计不久将会有更多的研究工作,来说明已经在何种程度上解决了凝胶色谱的相对测定过渡到绝对测定。凝胶色谱中的浓度检测器和通常的液体色谱一样仍然是一个薄弱环节,继续在寻找更理想的检测器。目前最常用的仍然是示差折光检测器和紫外检测器。
  Hoffmann和Urban用自动浊度滴定装置来作浓度检测器也收到一定效果,特别对二元共聚中测定分子量分布和组成分布,效果比较显着。Jorgenson等用光散射法侧定淋出溶质的沉淀,也证明是一个较灵敏的方法。Francois等用密度计来检侧浓度,提供了另一条通用性检测器的途径。其他如质谱和原子吸收光谱也都能与凝胶色谱联用。随着应用的扩大,凝胶色谱可以用于测定高聚物长支链的支化度。
  高效凝胶色谱
  在整个液体色谱领域里,高效液体色谱取代经典的液体色谱的趋势是非常迅速的。这是由于色谱理论、填料制备技术和仪器合理设计三方面联合发展的必然结果。凝胶色谱向高效阶段发展就其本身来说,又是一次意义较大的进展,因为凝胶色谱虽然具有许多优点,但是它一直被认为是一种分离效率比较低、色谱柱的峰容量小和速度慢的技术。在广泛的非高分子化合物领域中没有得到应有的使用。
  在经典的凝胶色谱中,填料的粒度一般用37-75μ。色谱柱长12尺以上,柱径7.8毫米,流速通常用1毫升/分。在这些条件下,一次实验时间往往需要三小时。加快流速会降低分离效率,因为凝胶色谱是一个由扩散控制的分离过程,高分子在溶液中扩散较慢,这就必然使流速受到一定限制。凝胶色谱峰容量较小的原因是和体积排除的分离机理有关。这些缺陷的克服都有待于填料柱效的大幅度提高。高效凝胶色谱填料的合成成功以及高效装柱技术的发展,实现了柱效的提高,从而实现了实验时间缩短,峰宽变窄和峰容量增加。
  现在粒度为10μ的填料可以使分子量分布测定时间从三小时缩短到十几分钟,这个时间甚至比高分子在溶剂中溶解所需的时间还短。在工业上已有人用凝胶色谱图来作为订购验收指定分子量分布的高聚物产品。由于不需要费太多时间来做条件试验,凝胶色谱在一般化合物领域里应用时的方便程度已可以和其他类型高效液体色谱相竞争。

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